紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量

一、實(shí)驗(yàn)原理

由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（OD280）與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。

利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是民迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中（特別是在柱層析分離中）得到廣泛應(yīng)用。此法的缺點(diǎn)是：（1）對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸的吸收高峰不同，并利用這一性質(zhì)，通過計(jì)算可以適當(dāng)校正核酸的干擾作用。

二、實(shí)驗(yàn)用品

(一)器材

    (1) 752紫外分光光度計(jì)。

    (2) 移液管。

(3)試管及試管架。  

  （二）試劑

     標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：準(zhǔn)確稱量經(jīng)微量凱氏定氮法校正標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用重蒸餾水配制成濃度為1mg/ml的溶液。

    (三)材料

         待測蛋白質(zhì)樣品溶液（用重蒸餾水適當(dāng)稀釋）。

三、實(shí)驗(yàn)程序

   1.標(biāo)準(zhǔn)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取8支試管，按表1-1分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。

選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm處分別測定各管溶液的OD280值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，OD280值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.樣品測定

    取適當(dāng)濃度的待測蛋白質(zhì)溶液，同樣選用光程為1cm的石英比色杯，測定280nm處的光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測定蛋白質(zhì)的濃度。